Forscher der University of Illinois Urbana-Champaign berichten, dass ein neues Werkzeug zur Genbearbeitung, das der Zellmaschinerie dabei hilft, Teile krankheitsverursachender Gene zu ignorieren, eingesetzt wurde, um die Bildung von Beta-Amyloid-Plaque-Vorläufern in einem Mausmodell der Alzheimer-Krankheit zu reduzieren.
Die Anwendung bei lebenden Mäusen zeige die verbesserte Wirksamkeit des Tools namens SPLICER im Vergleich zum aktuellen Standard der Gen-Editing-Technologie sowie das Potenzial für die Anwendung bei anderen Krankheiten, sagten die Forscher. Unter der Leitung von Pablo Perez-Pinera, einem Professor für Bioingenieurwesen an der University of I., veröffentlichten die Forscher ihre Ergebnisse in der Zeitschrift Natürliche Kommunikation.
SPLICER verwendet einen Gen-Editing-Ansatz namens Exon-Skipping, der besonders für Gesundheitsprobleme interessant ist, die durch Mutationen verursacht werden, die fehlgefaltete oder toxische Proteine produzieren, wie etwa Duchenne-Muskeldystrophie oder die Huntington-Krankheit.
„Die DNA enthält die Bauanleitung für alles, was für die Funktionsfähigkeit der Zellen verantwortlich ist. Es ist also wie ein Rezeptbuch mit sehr detaillierten Kochanweisungen“, sagte Perez-Pinera.
Aber es gibt große Bereiche der DNA, die für nichts kodieren. Es ist, als würde man mit einem Rezept für ein Truthahnessen beginnen und dann zu einer Notiz mit der Aufschrift „Fortsetzung auf Seite 10“ gelangen. Ab Seite 10 heißt es „Fortsetzung auf Seite 25“. Die Seiten dazwischen sind Kauderwelsch. »
Pablo Perez-Pinera, Professor für Bioingenieurwesen, University of Illinois at Urbana-Champaign
„Aber sagen wir mal auf einer der Rezeptseiten –; in der Genetik ein Exon –; Es gibt einen Tippfehler, der den Truthahn ungenießbar oder sogar giftig macht. Wenn wir den Tippfehler nicht direkt korrigieren können, bearbeiten wir möglicherweise die Notiz davor, um Sie zur nächsten Seite weiterzuleiten und die Seite mit dem Fehler zu überspringen, damit Sie am Ende einen essbaren Truthahn zubereiten können. Auch wenn Sie möglicherweise die Sauce verlieren, die auf der Seite mit dem Sautierten war, würden Sie trotzdem auf die gleiche Weise speisen. Wenn wir den Teil des Gens ignorieren, der die toxische Mutation trägt, könnte das resultierende Protein möglicherweise immer noch über genügend Funktionen verfügen, um seine entscheidenden Aufgaben zu erfüllen.
SPLICER basiert auf der beliebten Genbearbeitungsplattform CRISPR-Cas9 –; mit wesentlichen Änderungen. CRISPR-Cas9-Systeme erfordern eine spezifische DNA-Sequenz, an die sie sich heften können, wodurch eingeschränkt wird, welche Gene bearbeitet werden können. SPLICER verwendet neuere Cas9-Enzyme, die diese Sequenz nicht benötigen, und öffnet so die Tür zu neuen Zielen wie dem mit der Alzheimer-Krankheit in Zusammenhang stehenden Gen, auf das sich die Gruppe aus Illinois konzentrierte.
„Ein weiteres Problem, mit dem wir uns in unserer Arbeit befassen, ist die Präzision dessen, was ignoriert wird“, sagte Doktorand Angelo Miskalis, Co-Erstautor der Arbeit. „Bei aktuellen Exon-Skipping-Techniken werden manchmal nicht alle Exons übersprungen, sodass es immer noch einen Teil der Sequenz gibt, den wir nicht ausdrücken möchten. In der Rezeptbuch-Analogie ist es so, als würde man versuchen, eine Seite zu überspringen, aber die neue Seite beginnt mitten im Satz, und jetzt ergibt das Rezept keinen Sinn mehr. Das wollten wir vermeiden.
Um ein Exon herum gibt es zwei Schlüsselsequenzbereiche, die der Zellmaschinerie mitteilen, welche Teile eines Gens zur Herstellung von Proteinen verwendet werden sollen: einer am Anfang und einer am Ende. Während die meisten Exon-Skipping-Tools nur auf eine einzelne Sequenz abzielen, bearbeitet SPLICER sowohl die Start- als auch die Endsequenz. Dadurch werden gezielte Exons effizienter ignoriert, sagte Miskalis.
Um die therapeutischen Fähigkeiten von SPLICER zum ersten Mal zu demonstrieren, entschied sich die Gruppe aus Illinois dafür, auf ein Alzheimer-Gen abzuzielen, denn obwohl das Zielgen gut untersucht wurde, ist ein wirksames Exon-Skipping in lebenden Organismen noch nicht möglich. Die Forscher zielten auf ein bestimmtes Exon, das eine Aminosäuresequenz in einem Protein kodiert, das unter Bildung von Beta-Amyloid gespalten wird, das sich mit fortschreitender Krankheit ansammelt und Plaques auf Neuronen im Gehirn bildet.
In kultivierten Neuronen reduzierte SPLICER wirksam die Bildung von Beta-Amyloid. Bei der Analyse der DNA- und RNA-Produktion im Gehirn von Mäusen stellten die Forscher fest, dass das Ziel-Exon bei mit SPLICER behandelten Mäusen um 25 % verringert war, ohne dass es Hinweise auf Off-Target-Effekte gab.
„Als wir zunächst versuchten, dieses Exon mit älteren Techniken ins Visier zu nehmen, funktionierte es nicht“, sagte die Doktorandin Shraddha Shirguppe, ebenfalls Co-Erstautorin der Studie. „Durch die Kombination der neuen Basiseditoren mit der Doppelspleißbearbeitung war es möglich, das Exon viel schneller zu überspringen, als wir es zuvor mit allen verfügbaren Methoden konnten. Wir konnten zeigen, dass es nicht nur das gesamte Exon besser überspringen konnte, sondern auch das Protein reduzierte, das in diesen Zellen Plaque produziert.
„Exon-Skipping funktioniert nur, wenn das resultierende Protein noch funktionsfähig ist, es kann also nicht alle Krankheiten mit genetischer Basis behandeln.“ Das ist die allgemeine Einschränkung des Ansatzes“, sagte Perez-Pinera. „Aber für Krankheiten wie Alzheimer, Parkinson, Huntington oder Duchenne-Muskeldystrophie hat dieser Ansatz großes Potenzial. Der unmittelbar nächste Schritt besteht darin, die Sicherheit der Entfernung gezielter Exons bei diesen Krankheiten zu untersuchen und sicherzustellen, dass wir kein neues Protein schaffen, das toxisch ist oder dem eine Schlüsselfunktion fehlt. Wir müssten auch längerfristige Tierstudien durchführen und sehen, ob die Krankheit mit der Zeit fortschreitet.
In Illinois ist Perez-Pinera außerdem mit der Abteilung für Molekulare und Integrative Physiologie, dem Carle Illinois College of Medicine, dem Cancer Center of Illinois und dem Carl R. Woese Institute for Genomic Biology verbunden. Die Bioingenieurprofessoren Sergei Maslov und Thomas Gaj von der U of I waren Co-Autoren des Artikels. Die National Institutes of Health, die Muscular Dystrophy Association, die American Heart Association, die Parkinson’s Disease Foundation und die Simons Foundation unterstützten diese Arbeit.
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